简述NEST细胞培养以单管冻存细胞进行培养的实验方案

　　NEST细胞培养是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种菌种分为母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。
 

　　NEST细胞培养的冻存:为避免污染造成的损失，至小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。
 

　　NEST细胞培养培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。
 

　　NEST细胞培养下列步骤以单管冻存细胞进行培养的实验方案为例。
 

　　1、准备一烧杯37°C的水。
 

　　2、从液氮储存中取出一管细胞，注意保护手和眼睛。
 

　　3、拧松管盖1/4圈，等待10秒钟以释放螺纹中可能残留的液氮，再重新拧紧管盖。
 

　　4、将冻存管的下半部分置于37°C水浴中进行解冻，直至冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞迅速解冻。
 

　　5、用消毒液擦拭管体外表面，再将其移至II级A型层流细胞培养通风橱中。
 

　　6、打开管盖，使用1mL移液器上下吹打细胞悬液以分散细胞。
 

　　7、从管中吸取20uL细胞悬液，并将其稀释于20uL台盼蓝溶液中。
 

　　8、使用血细胞计数板来确定每毫升悬液中的活细胞数。
 

　　9、将管中悬液(1mL)稀释至产品说明中的推荐浓度。
 

　　10、将5mL细胞悬液加入25cm2培养瓶，或将15mL细胞悬浮液加入75cm2培养瓶中。
 

　　11、摇匀培养瓶中的培养基以*分散细胞。许多类型的细胞都会迅速贴壁，如果没有在传代后即刻摇匀细胞，细胞可能生长不均匀。
 

　　12、在37°C、5%CO2/95%空气、湿度细胞培养箱中培养细胞。为了获得*结果，培养开始后至少在24小时之内不要扰动细胞。